martes, julio 14, 2020
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PREGUNTAS FRECUENTES: ¿Qué es una PCR? ¡Así se diagnostica la COVID-19!

¿Y UNA RETROTRANSCRIPCIÓN, TRANSCRIPCIÓN REVERSA O INVERSA, O RT? ¿Y UNA PCR CUANTITATIVA?

Las siglas PCR hacen referencia a polymerase chain reaction, es decir, reacción en cadena de la polimerasa. Una PCR es una técnica de biología molecular que se utiliza para generar un gran número de copias de un determinado gen o fragmento génico.

¿Cómo se hace una PCR?

Se parte de DNA (extraído de un cultivo de células, de un cultivo de bacterias, de una muestra humana…, de dónde sea). Se requiere,además, de una pareja de primers o cebadores: pequeñas secuencia de nucleótidos que sean idénticos a los extremos del gen que queremos amplificar.

Además, se necesita una enzima polimerasa, unas proteínas capaces de copiar secuencias génicas. Y por supuesto, nucleótidos “sueltos” para que esa polimerasa pueda copiar la secuencia que le están indicando los cebadores.

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr

Cuando tú tienes todos los componentes en un eppendorf adecuado lo introduces en un termociclador. Un termociclador, es un aparato que sube y baja la temperatura de forma cíclica para permitir que la polimerasa haga su acción.

En primer lugar, se requiere que las dos cadenas del DNA se separen (se desnaturalicen). Después, que los primers se unan. Y a continuación, que la polimerasa copie. Para cada paso se requiere cierta temperatura y esto es lo que proporciona el termociclador.

Si estos pasos se repiten consecutivamente el número de moléculas del gen amplificado aumentará exponencialmente. De 1 molécula a 2, de 2 a 4, de 4 a 8, de 8 a 16, de 16 a 32…

¿El resultado? Un gran número de copias de DNA que luego podremos analizar mucho más fácilmente al tener mucha más cantidad.

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr

¿Y UNA RETROTRANSCRIPCIÓN, TRANSCRIPCIÓN REVERSA O INVERSA, O RT?

Si la transcripción es el paso de DNA a RNA. Una retrotranscripción o transcripción reversa o inversa, (abreviada RT), será el paso contrario: transformar el RNA en DNA. Este DNA se llamará entonces: cDNA

¿Para qué es útil la RT? Para medir la expresión génica.

Todas las células de un organismo contienen los mismos genes, sin embargo, no todas los expresan todos. Recordemos que el DNA de nuestro genoma se transcribe a RNA y este se traduce a proteínas, las encargadas de realizar la función que dicta dicho gen. Así, un hepatocito expresará genes que no exprese una neurona, y por ello, serán células que no se parezcan en nada, pese a poseer los mismos genes.

Por ese motivo, si queremos analizar la expresión de los genes no podemos utilizar directamente el DNA, porque siempre es el mismo, tenemos que utilizar el RNA (el paso que indica que ese gen se ha expresado, se ha transformado a RNA y luego a la proteína correspondiente).

El proceso es muy similar al de una PCR. Solo que en este caso se parte de RNA, se utilizan primers de la región a retrotranscribir, nucleótidos y una polimerasa algo especial porque no tiene que copiar DNA, si no convertir RNA en DNA.

¿El resultado? El mismo: un montón de copias de cDNA partiendo de unas pocas de RNA.

¿QUÉ ES UN PCR CUANTITATIVA, EN TIEMPO REAL O qPCR?

El concepto es el mismo que el de una PCR clásica. La diferencia es que con la PCR cuantitativa eres capaz de “contar” la cantidad de copias que se generan.

¿Cómo lo haces? Aunque hay varias posibilidades lo más común es añadir, a toda la mezcla de componentes necesarios, una sonda marcada. Una sonda no deje de ser otra secuencia de nucleótidos que esta vez es idéntica al centro de tu gen de interés.

De esta forma cuando se separan las dos hebras del DNA además de unirse los primers a los dos extremos, esta sonda se une justo en medio de la secuencia. Entonces, llegará la polimerasa y comenzará a copiar.

¿Qué ocurre cuando la polimerasa se topa con la sonda? Que la degrada para poder copiar esa parte del gen. Esta degradación de la sonda hace que emita algo medible: fluorescencia.

*Otra opción es utilizar un compuesto fluorescente que se intercale entra las dos hebras de DNA de forma que solo se detecte cuando la copia esté completa.

https://www.takarabio.com/learning-centers/real-time-pcr/overview/one-step-rt-qpcr-kits

Este tipo de PCR se realiza en termocicladores especiales, que además de variar la temperatura, te porporcionan la cantidad de fluorescencia que detectan.

¿Cuál es el otro kit de la cuestión? Que normalmente se parte de cDNA, es decir RNA que se ha reconvertido en DNA. (La técnica completa se llama RT-qPCR, ya que se realiza una RT como paso previo a la propia qPCR). De esta forma, lo que haces es medir la expresión de dicho gen.

Así, si hablamos de un gen que se expresa poco en la muestra, pongamos que partimos de 1 copia, el número de moléculas finales será menor que si es un gen muy común y partimos de 100. Ahí está el misterio de la PCR cuantitativa. Puedes analizar un mismo gen en diferentes muestras y condiciones, y ver la relación entre ellas.

Y esto amigos es lo que se hace para diagnosticar la COVID-19. Ver si en las células de la muestra de un paciente se encuentra el RNA del virus.

El genoma del SARS-CoV-2 es de RNA, de forma que es introducido por el virus de forma directa en la célula. Allí, nuestra maquinaria de traducción) lo reconoce como un RNA propio y comienza a producir proteínas (es decir, las herramientas para construir más virus).

Por tanto, si en nuestras células hay RNA vírico, este se transformará a cDNA vírico con la RT. Después, con la qPCR se harán copias y dará señal de fluorescencia medible.

RESULTADO POSITIVO: CONTAGIADO DE COVID-19.

Si en nuestras células no hay RNA vírico, no habrá RNA que transformar a cDNA, y por tanto, faltará el molde para realizar copias en la qPCR. Consecuetemente no habrá copias, ni señal fluorescente.

RESULTADO NEGATIVO: NO CONTAGIADO DE COVID-19.

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María Iranzohttps://www.mariairanzobiotec.com/
Me apasiona la biotecnología y mi sueño es ayudar a descubrir la cura del cáncer. Actualmente formo parte del grupo de investigación de etiología y terapéutica de enfermedades periodontales. Máster en Bioquímica, biología molecular y biomedicina (UCM). Graduada en #Biotecnología (UdL).

1 COMENTARIO

  1. Lo del ADN y lo del ARN lo entiendo, lo estudie en Biología de COU.
    Pero lo o demás que has explicado se escapa a mi entendimiento.
    Si nos quieres acercar la ciencia, esta clase la tendrás que explicar de otra manera.
    Gracias

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