miércoles, abril 8, 2020
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Inmortalización celular e infección lentiviral: de fibroblasto a hepatocito en daño hepático causado por medicamentos

Esta semana hablaremos de la transformación de fibroblastos humanos en hepatocitos utilizando dos técnicas biotecnológicas: la infección con vectores lentivirales y la inmortalización celular. ¿La finalidad? Estudiar una situación de alto componente idiosincrático: el daño que causa en el hígado de cada persona el consumo de medicamentos. ¿Los autores? La Unidad de Hepatología Experimental del Instituto de Investigación Sanitaria La Fe de Valencia… ¡SIGUE LEYENDO!

¿En qué consiste esta estrategia?

En partir de células somáticas (cualquier célula de nuestro cuerpo menos las células sexuales) del individuo en estudio, y transformarlas en células con un fenotipo similar a los hepatocitos (lo que en inglés se denomina hepatocyte-like cells) para poder trabajar con ellas de forma in vitro.

Para ello, debemos hablar de dos estrategias: la inmortalización celular y la infección lentiviral; y de algún otro concepto como: línea celular o cultivo primario.

Si nos ponemos en contexto, para estudiar el daño hepático de un paciente lo más obvio sería aislar hepatocitos del propio paciente y cultivarlos. El utilizar células obtenidas directamente de un órgano o tejido se denomina cultivo primario. ¿Cuál es su principal desventaja? Que su crecimiento in vitro es muy limitado. Y a esto hay que sumarle la dificultad de extraer hepatocitos de un paciente.

* No sé si os lo termináis de imaginar, o habéis trabajado alguna vez con cultivos celulares. Cuando hablamos de cultivar células hablamos de extenderlas sobre diferentes “platitos” y esperar a que crezcan para experimentar con ellas o despegarlas y mantenerlas en cultivo, volviéndolas a poner en otro plato o placa. De hecho se llama in vitro por el material original de estas placas, el vidrio.

¿Cuál suele ser la alternativa a estos cultivos primarios?

Realizar una transformación o inmortalización celular. Es decir, coger ese cultivo primario e inducir algún cambió para que esas células puedan multiplicarse indefinidamente, vamos, volverlas inmortales. En este caso, estaríamos hablando de una línea celular. Un conjunto de células que tú puedes mantener indefinidamente en cultivo para trabajar con ellas de forma cómoda.

¿Las desventajas? El proceso de inmortalización puede alterar su fenotipo (las características observables derivadas de combinar genes y ambiente), y hacer que no sean idénticas a las células originales.

¿Cómo es posible inmortalizar una célula? Pues puede parecer algo retorcido pero existen unas cuantas estrategias. En este caso nos centraremos en el método seguido por estos investigadores: utilizar el antígeno T grande del SV40.

El SV40 es un virus capaz de infectar simios y humanos. ¿Qué lo hace interesante? Un gen que alberga en su genoma. Este gen produce la proteína conocida como antígeno grande del SV40. Esta proteína es capaz de bloquear la acción de p53.

Aunque ya hemos hablado en otras ocasiones de este supresor tumoral, haremos un pequeño recordatorio. p53, conocido como el guardián del genoma, es la proteína encargada de detectar daños irreparables en el genoma de nuestras células y activar su muerte.

De esta forma, se evita que daños en el DNA (que pueden acabar conduciendo a mutaciones y tumores, o simplemente daños debidos al envejecimiento de la célula) se transmitan a nuevas células.

¿Qué consigue el antígeno grande del SV40? Se une a una región imprescindible para la función de p53, bloqueando por completo su acción. Así, esa célula será incapaz de detectar los cambios dañinos en el genoma y nunca morirá, convirtiéndose en, literalmente, inmortal.

De hecho, p53 se conoce como supresor tumoral porque frena la acumulación de mutaciones que podrían conducir a un cáncer. Desgraciadamente, es uno de los principales genes que aparecen alterados en las células tumorales, que si lo pensamos, también son inmortales.

Vayamos ahora a la infección lentiviral. Este concepto es fácilmente comprensible si entendemos cómo funciona un virus. Un virus entra en contacto con nuestra célula y le inserta su material genético.

De esta forma, el DNA (o RNA) del virus se multiplica utilizando nuestras propias células, para luego salir y seguir infectando. Pues bien cuando nos referimos a infección lentiviral estamos hablando de coger esos virus, hacer ciertos cambios en su genoma para que no tengan esa capacidad de ir saltando de célula en célula, y añadirle nuestro gen o genes de interés.

@HeberLongas (Twitter). En la imagen podemos observar el ciclo del VIH (un virus lentiviral, y en el que se basan muchos de estos sistemas de infección). En nuestro caso el genoma del virus estaría modificado para impedir el ciclo a partir del paso 6. El ADN maligno del virus ya sería capaz de salir del genoma. Es decir, no podría generar nuevos virus.

¿Qué conseguimos así? Que utilizando un mecanismo propio de los virus, estos introduzcan en el genoma de las células los genes que a nosotros nos interesan.

Ya aclarados los conceptos, ahora podemos entender mejor el trabajo de este grupo de investigadores: Una vez aislados los fibroblastos de la piel de los pacientes, estas células fueron sometidas a dos infecciones lentivirales.

En primer lugar, para introducir en su genoma el antígeno T grande del SV40 y así volverlas inmortales para trabajar fácilmente in vitro. Y en segundo lugar, con un cocktail de genes necesario para expresar un fenotipo de hepatocito.

¿Qué cocktail de genes? Genes para tres factores de transcripción: HNF4A, HNF1A y FOXA3. Los factores de transcripción son las proteínas encargas de inducir la expresión (transformación en proteína) de otros genes.

Estos 3 factores de transcripción son claves para expresar genes imprescindibles para un fenotipo hepático. Es decir, estos factores de transcripción inducen la expresión de genes que proporcionan a una célula las características propias de una célula del hígado.

¿Un detalle más? Estos investigadores utilizaron un sistema de expresión de los factores de transcripción inducible. Es decir, estos factores solo se expresarán, y transformarán la célula en hepatocito, cuando nosotros queramos. ¿Cómo? Utilizando un promotor activable por doxiciclina.

*De forma muy sencilla: la secuencia de cualquier gen viene precedida por otra secuencia, el promotor. Este promotor es el que se encarga de permitir, o no, la expresión de los genes que tiene por delante. Es precisamente, en esta región donde se une los factores transcripcionales para activar la expresión de los genes que controlan.

En este sistema específico, los 3 factores de transcripción se han insertado en el genoma de los fibroblastos con un promotor delante. Promotor que solo se activa e induce la expresión de dichos factores cuando los investigadores añadían al cultivo doxiciclina.

Si este antibiótico no está presente, las células siguen siendo fibroblasto y se pueden mantener indefinidamente en cultivo. Si se añade doxiciclina, los factores de transcripción se expresan y pueden inducir, a su vez, la expresión de los genes que “transformarán” el fibroblasto en hepatocito.

http://maph49.galeon.com/arn/initprom.html

¿El resultado? Células propias de un paciente (con su genoma), aisladas fácilmente (de la piel), inmortalizadas (nunca morirán) y con características de los hepatocitos de ese mismo paciente (por la acción a estos tres genes).

http://wzar.unizar.es/acad/histologia/paginas_hg/04_TejConj/TCcelulas/Fibrobl_40.htm https://www.lifeder.com/hepatocitos/

Gracias a esta estrategia se consigue trabajar in vitro con células propias de cada enfermo, evitando el uso de cultivos primarios y sus desventajas, y pudiendo estudiar las alteraciones características de cada paciente en respuesta al daño hepático por fármacos.

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https://stemcellres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13287-019-1416-5

María Iranzohttps://www.mariairanzobiotec.com/
Me apasiona la biotecnología y mi sueño es ayudar a descubrir la cura del cáncer. Actualmente formo parte del grupo de investigación de etiología y terapéutica de enfermedades periodontales. Máster en Bioquímica, biología molecular y biomedicina (UCM). Graduada en #Biotecnología (UdL).

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