lunes, diciembre 5, 2022
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Extracción y cuantificación de proteínas

Hemos hablado en profundidad de cómo se trabaja con los ácidos nucleicos (ADN y ARN) en el laboratorio, de cómo se extraen, se cuantifican o se analiza su integridad. Por eso hoy saltamos a otras de las grandes protagonistas de los seres vivos: las proteínas. ¿Cómo se realiza la extracción y cuantificación de proteínas? ¿Por qué es útil extraer y analizar las proteínas? ¡SIGUE LEYENDO!

Si no te desenvuelves todavía en el campo de las proteínas, te recomiendo que eches un vistazo a la sección CIENCIA PARA NOVATOS. Tras leerla, podrás entender a la perfección este post.

De cualquier forma, haremos un breve resumen a modo de introducción:

¿QUÉ SON LAS PROTEÍNAS?

Las proteínas son moléculas compuestas por aminoácidos. Una proteína es como un collar de perlas, y las perlas son los aminoácidos. La combinación de aminoácidos, o perlas, dará una proteína u otra.

Esta secuencia de aminoácidos es lo que se conoce como estructura primaria de las proteínas. Pero esta no es útil para desempeñar la inmensidad de funciones que tienen las proteínas en tu cuerpo, en el de una planta o en el de una bacteria. Por ello, las proteínas van pasando por diferentes estados de plegamiento: estructura secundaria, terciaria y algunas, también cuaternaria. Ya plegadas, son capaces de desempeñar la función que les corresponde.

¿De dónde vienen las proteínas?

Cada gen codifica para una proteína. Los genes son secuencias de ADN, que se transcriben (se transforman) a otra molécula el ARN, que se traduce (transforma) a otra molécula, la proteínas.

¿Qué funciones puede tener una proteína? Estructurales, enzimáticas, transportadoras, inmunológicas, hormonales..

¿Qué puede ocurrirles a las proteínas? Que se desnaturalicen. El término desnaturalizar hace referencia a la perdida de las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de una proteína. Al perder su estructura también pierden su función. Eso es lo que ocurre cuando una proteína se desnaturaliza.

Y el ejemplo fácil es la clara del huevo: cuando la cueces, la sometes a una alta temperatura que desnaturaliza sus proteínas, por eso cambia de textura y color.

¿Por qué es útil analizar la proteínas de una muestra?

A nivel clínico para analizar síndromes, enfermedades, detectar marcadores moleculares… A nivel de investigación, para analizar la expresión de genes, ver como varía en función de tratamientos o condiciones, analizar la interacción proteica…

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

Ahora que nos hemos situados vayamos al grano. ¿Cómo “saco” una proteína de una muestra, sea un cultivo celular, un tejido, una muestra de orina, de sangre…?

En primer lugar, debemos entender dónde está la proteína que queremos obtener. ¿En la matriz o medio extracelular del tejido o fluido? ¿En la membrana plasmática de la célula? ¿En su interior? En función de cómo contestemos a esta pregunta elegiremos unos u otros ingredientes para lo que conocemos como tampón de extracción. Este tampón será la solución con la que y en la que extraeremos las proteínas.

¿Cuáles son los componentes más comunes de un tampón de extracción?

El tampón llevará detergentes (capaces de solubilizar proteínas), inhibidores específicos (agentes quelantes…), sustratos y cofactores enzimáticos (en caso de que busquemos una enzima), inhibidores de las proteasas (para evitar la degradación proteica), nucleasas (para eliminar los ácidos nucleicos)…

¿Cuáles son los pasos de la extracción?

En primer lugar, se realizará la lisis celular de la muestra, en frío (para evitar la desnaturalización proteica), en presencia del tampón de extracción y por agitación, pipeteo o rascado. Tras la lisis, se obtiene el homogeneizado, una suspensión con todos los componentes celulares.

A continuación, se deben eliminar los contaminantes, es decir, cualquier cosa que no sean proteínas. Para ello, se suele optar generalmente por la centrifugación o la filtración, descartando el pellet y conservando el sobrenadante.

También se puede optar por lo contrario, si no se requieren las proteínas en estado nativo: precipitar las proteínas, eliminar el sobrenadante y conservar el pellet.

Tras estos pasos, se obtiene el extracto clarificado, es decir, una mezcla de las proteínas totales de las células de la muestra en cuestión.

En este punto, se podrían eliminar todas las proteínas excepto la de interés a través del fraccionamiento, e inclusopara eliminar las proteínas muy parecidas a la de interés mediante la purificación.

Sin embargo, estos dos últimos pasos son menos comunes a nivel de investigación general. En este sentido, se opta por el extracto clarificado, una mezcla de proteínas que luego se cuantificará y analizará mediante otras técnicas como el Western Blot, el ELISA, la inmunoprecipitación…

¿Pero qué ocurre si no partimos de un conjunto de células si no de un tejido?

En primer lugar y como paso previo a la lisis celular, se deberá eliminar la matriz extracelular, el cemento que mantiene pegadas entre sí a las células formando el tejido. Para ello, se pueden emplear los sistemas mecánicos e hidrodinámicos, u optar por enzimas específicas para cada tipo de tejido, por ejemplo colagenasas para tejidos ricos en colágeno.

Lo mismo ocurrirá si el material de partida es un tejido conservado en otros materiales como la parafina, que deberán ser previamente eliminados.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS

Tras haber extraído las proteínas, para realizar algunas técnicas de análisis posterior, es necesario realizar una cuantificación de las mismas. ¿Cómo cuantificamos las proteínas de mi muestra?

1. ABSORBANCIA

*PARENTESIS. La absorbancia no es más que la cantidad de luz que absorbe una molécula, la que sea: un ácido nucleico, una proteína, un producto coloreado… Así, es fácil entender que cuanto mayor sea la concentración de dicha molécula mayor será la cantidad de luz absorbida, y menor la luz capaz de atravesar dicha muestra.

Para verlo fácilmente: imagina una ventana con una maceta justo en la repisa. La luz que atravesará la ventana será mucho menor que si no tuviéramos maceta. La maceta entorpece, absorbe más, el paso de la luz. Esto es lo que debes entender.

Teniendo en cuenta que cada molécula absorbe la luz a una longitud de onda específica es posible calcular su concentración en una muestra.

*PARENTESIS DE NUEVO. La luz no deja de ser un tipo de energía que se propaga en forma de ondas. La longitud de onda mide la anchura de esas ondas en nanómetros (nm). Así, mientras que la luz visible tiene una longitud de onda determinada, la luz UV tiene otra, los rayos X otra…

Traduccion_Proteinas_Blog_Maria_Iranzo_Biotec_Biotecnologia
https://es.khanacademy.org/science/biology/photosynthesis-in-plants/the-light-dependent-reactions-of-photosynthesis/a/light-and-photosynthetic-pigments

Pero sigamos. Con arreglo a la ley de Lambert-Beer, existe una relación lineal entre la absorbancia A y la concentración de la molécula, conforme a la siguiente ecuación:

A = DO = ε x l x c

donde ε es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración y l es el paso de luz del recipiente donde se coloca la muestra (su anchura).

¿Cómo se mide la absorbancia de la muestra?

Con un aparato llamado espectrofotómetro. El aparato funciona conforme a un principio sencillo: se irradia una muestra con una radiación luminosa de longitud de onda conocida y se mide la energía luminosa transmitida con una célula fotoeléctrica situada detrás de la muestra.

Así, la cantidad de proteínas en nuestra muestra podremos determinarla extrapolando a partir de una curva de calibración. Así, midiendo la cantidad de luz que absorben concentraciones conocidas de proteínas (marcadas con el color) podremos hacer una recta: concentración vs. absorbancia. Posteriormente, con la absorbancia de nuestra muestra, solo deberemos despejar de la ecuación de la recta la concentración proteica.

ABSORBANCIA DIRECTA DE LAS PROTEINAS

Por un lado la absorción de la luz ultravioleta (280 nm) de los anillos aromáticos de algunos aminoácidos: tirosina, triptófano y fenilalanina. En esencia, es igual que los métodos colorimétricos pero sin tener que adicionar ningún compuesto (los métodos colorimétricos inutilizan la parte de la muestra proteica utilizada en la cuantificación).

La principal desventaja es que se asume que todas las proteínas tienen la misma proporción de residuos aromáticos. En este sentido, los métodos colorimétricos son más precisos.

Otra opción es la absorción a 190 nm. ¿Por qué? Porque es la longitud de onda a la que absorbe el enlace peptídico, el enlace que une los aminoácidos entre sí. Sin embargo, pueden generarse interferencias con los disolventes y la mayoría de los aparatos espectrofotométricos no llegan a medir a esas longitudes de onda tan bajas.

ABSORBANCIA INDIRECTA: MÉTODOS COLORIMÉTRICOS

Estos métodos, los más utilizados, consisten en hacer reaccionar las proteínas con un reactivo que genere un producto coloreado capaz de ser medido por absorbancia. Cuanto más intenso sea el color detectado más concentración de proteínas contendrá la muestra.

Entre los métodos colorimétricos encontramos:

Bradford: utiliza el azul de Coomassie, un colorante cargado negativamente que se une a las proteínas con carga positiva.

Lowry: se trata de una reacción en dos pasos. Primero, el cobre del sulfato de cobre interacciona con el nitrógeno de las proteínas, y a continuación, el reactivo de Folin reacciona con el cobre unido a las proteínas produciendo un compuesto de color azul verdoso.

BCA: Igual que el método de Lowry, se trata de una reacción en dos pasos en la que los iones cobre del sulfato de cobre interaccionan en primer lugar con las proteínas. A continuación, el ácido bicinconínico interacciona con el cobre unido a las proteínas generando un compuesto de color violeta.

Todos tienen ciertas limitaciones: en algunos hay ciertos compuestos que interfieren, otros dependen de la composición de las proteínas por su afinidad a ciertos aminoácidos…

3. FLUORIMETRÍA

La esencia es similar a la de los métodos colorimétricos. En este caso se utiliza una molécula fluorescente que se une a las proteínas y luego es detectada por un fluorímetro. La cantidad de fluorescencia detectada por este aparato será proporcional a la cantidad de proteínas de la muestra.

4. HIDRÓLISIS ÁCIDA Y ANÁLISIS DE LOS AMINOÁCIDOS RESULTANTES

En realidad, es la única manera precisa de determinar la concentración exacta de la proteína: romper los enlaces peptídicos y cuantificar los aminoácidos. Sin embargo, como no es útil una proteína fragmentada, no es un método que se suela utilizar.

5. MÉTODO KJELDAHL

Finalmente, este método se basa en la determinación del contenido en nitrógeno. Se suele utilizar para muestras sólidas complejas y muestras microbiológicas. Se puede aplicar a muestras microbiológicas de tierra.

Una vez cuantificadas las proteínas, ¿Qué técnicas se suelen utilizar en su análisis? ¡Muy pronto en la web!

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María Iranzo
María Iranzohttps://www.mariairanzobiotec.com/
Soy biotecnóloga por la Universitat de Lleida (UdL) y máster en Bioquímica, biología molecular y biomedicina por la Universidad Complutense de Madrid (UCM). Me dedico a la investigación biomédica pero me apasiona la biotecnología y la divulgación científica.

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