Hoy engrosamos la sección de técnicas de laboratorio hablando de uno de los procesos más básicos, necesarios y utilizados en cualquier laboratorio de investigación: la extracción de los ácidos nucleicos y su purificación. ¿Por qué es útil extraer los ácidos nucleicos? ¿Cuáles son las principales técnicas utilizadas? ¿Son útiles tanto para DNA como RNA? ¡Sigue leyendo!
¿POR QUÉ ES UTIL O PARA QUÉ SIRVE EXTRAER LOS ÁCIDOS NUCLEICOS DE UNA CÉLULA?
La extracción y purificación de los ácidos nucleicos es el paso previo a técnicas como la secuenciación, la PCR o las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos.
En el caso del DNA, todas ellas encaminadas a analizar la secuencia génica de una célula u organismo para determinar enfermedades genéticas, comprobar la presencia o ausencia de mutaciones, determinar la presencia o ausencia de genes….
En el caso del RNA, para determinar qué genes concretos se están expresando en un tejido, célula, organismo. Lo cual es útil para analizar patrones de expresión de células tumorales u otro tipo de enfermedades, determinar la expresión de genes bajo la acción de determinados fármacos o terapias, comprobar la posible edición génica realizada en un laboratorio…
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS
Empezaremos por lo básico. Para extraer, es decir, obtener el DNA o el RNA de una célula el primer paso es romper todas las estructuras que lo protegen, es decir, debemos romper las células del material de partida (sangre, saliva, heces, un cultivo…), a este proceso se le conoce como lisis celular. Después, el extracto celular obtenido se centrifuga para eliminar los restos celulares no disueltos. Y por último, llegaría la propia purificación: separar los ácidos nucleicos del resto de componentes solubles de la célula, como por ejemplo las proteínas.
Lisis celular
La lisis celular, o mejor dicho la forma de realizarla, dependerá del tipo concreto de célula del que queramos obtener el DNA o RNA. En función del tipo celular, esta tendrá pared o solo membrana celular y por tanto, la técnica a utilizar será distinta.
En este sentido, existen diferentes alternativas:
Degradación de la pared
En el caso de que las células tengan pared (bacterias, células vegetales, levaduras…), su eliminación se puede lograr mediante enzimas o tratamientos mecánicos.
Entre los métodos mecánicos podemos encontrar: las batidoras o molinos de bolas, los moldes con abrasivos, las prensas, la sonicación, la agitación o el uso de nitrógeno líquido en mortero. Entre las enzimas: las lisozimas (para degradar el peptidoglicano de la pared bacteriana), las liticasas o zimoliasas (para las levaduras), las quitinasas (para la quitina de la pared de los hongos)…
Degradación de la membrana plasmática
Una vez que la pared está degradada, o en el caso de que directamente solo tengamos que romper la membrana plasmática, podemos decantarnos o bien por el uso de detergentes o bien por realizar una lisis osmótica.
La lisis osmótica se basa en el fenómeno de la osmosis por el cual la concentración de dos compartimentos separados por una membrana permeable al agua siempre tiende a igualarse. De esta forma, el menos concentrado cederá agua al más concentrado para igualar sus concentraciones. En nuestro caso si ponemos una célula en agua pura, la célula muy concentrada absorberá agua y literalmente explotará.
Los detergentes, a su vez, solubilizan las proteínas que forman la membrana lipídica, impidiendo así las interacciones entre proteínas y lípidos que la mantienen estructurada.
¿Pero qué ocurre si no partimos de un conjunto de células si no de un tejido?
En primer lugar y como paso previo a la lisis celular, deberemos eliminar la matriz extracelular, el cemento que mantiene pegadas entre sí a las células formando el tejido. Para ello se pueden emplear los sistemas mecánicos e hidrodinámicos ya mencionados, u optar por enzimas específicas para cada tipo de tejido, por ejemplo colagenas para tejidos ricos en colágeno.
Lo mismo ocurrirá si el material de partida es un tejido conservado en otros materiales como la parafina, que deberán ser previamente eliminados.
Centrifugación
Una vez las células de nuestro material de partida están rotas, todo el contenido celular liberado (fragmentos de membrana, orgánulos no fragmentados, citosol, el contenido nuclear…) se suele centrifugar para separar los fragmentos sólidos de los componentes disueltos. De esta forma, lo soluble quedará en el sobrenadante (la parte superior líquida que se obtiene tras la centrifugación) y lo insoluble en el pellet (la parte sólida que se acumula en el fondo).
PURIFICACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS
Una vez lisadas las células, eliminados todos los fragmentos sólidos y conservados únicamente sus componentes solubles (los cual se denomina extracto celular y en el que se encuentran ácidos nucleicos pero también proteínas), pasaríamos a la purificación de los ácidos nucleicos. Esta purificación puede realizarse utilizando diferentes métodos.
Precipitación mediante sales y alcoholes
Se trata de la técnica más básica y rápida para obtener ADN y que engloba también la propia lisis celular. Consiste, en primer lugar, en someter a las células a la lisis utilizando un detergente que solubilice los componentes celulares e inhiba la acción de las nucleasas intracelulares. A continuación, se desnaturalizan y se eliminan las proteínas por precipitación salina (con grandes cantidades de sal, las proteínas son insolubles en agua, por lo que interaccionan hidrofóbicamente entre ellas y precipitan).
Tras eliminar el precipitado proteico, el ADN en solución se precipita con isopropanol (el ADN es insoluble en alcohol en presencia de sales) y se lava con etanol para finalmente ser resuspendido en un tampón estabilizante para ADN.
En caso de querer eliminar el RNA (si hay grandes concentraciones o realmente estorba) solo hay que tratar la muestra con RNAasas, las enzimas que degradan el RNA, antes de precipitar las proteínas.
Solventes orgánicos: Fenol-cloroformo
El método más tradicional para purificar DNA se basa en el uso de un solvente orgánico, el fenol. El extracto celular se mezcla con una solución de fenol: cloroformo y al centrifugarse se generan dos fases y una interfase.
- La fase superior es acuosa y contiene el DNA y el RNA. Esta parte contiene el buffer, la parte hidrófila (soluble en agua), el DNA…
- La fase inferior contiene el fenol. En la fase de abajo se encuentran todas las moléculas hidrofóbicas (no solubles en agua) junto con el fenol y el cloroformo.
- La interfase gruesa y blanquecina está formada por la coagulación de las proteínas desnaturalizadas por el fenol y el cloroformo.
En este punto, a la fase acuosa se le añade alcohol (etanol, isopropanol…) y sales (acetato de sodio) para provocar la precipitación de los ácidos nucleicos. Así, el ADN que está cargado negativamente por los fosfatos interaccionará con el sodio de la sal. El agua no podrá competir con el sodio, por lo que el ADN quedará neutro, sin carga, y precipitará formando un coágulo.
En este caso, para eliminar el RNA también se optaría por un tratamiento con RNAsas.
Solventes orgánicos: Fenol-GI (Trizol) y Cloroformo
Este método es muy similar al utilizado para purificar el DNA pero está, sin embargo, enfocado a obtener el RNA. Para purificar el RNA total se utiliza una mezcla de fenol:cloroformo acido con una solución de Isocianato de guanidinio (GI). El GI es una sal caotrópica que desnaturaliza proteínas, incluidas las ARNasas.
Los agentes caotrópicos rompen los puentes de hidrogeno que se establecen entre las moléculas de agua, por lo que su estabilidad como disolvente se altera y esto afecta a la solubilidad de otras moléculas como las proteínas, que acaban coagulando.
En este medio ácido, las cargas negativas del ADN quedan bloqueadas con los protones del medio. Por el contrario, el ARN, al ser monocadena y tener las bases nitrogenadas expuestas (las cargas positivas de las mismas harán que sea más soluble en agua) se mantiene disuelto.
En estas condiciones, tanto las proteínas como el DNA se quedan en la interfase y solo el RNA permanece disuelto en la solución.
Destacar que en este y en otros métodos dirigidos a extraer y purificar el RNA es importante utilizar materiales, buffer y la propia agua libre de RNAasas. El RNA es un material extremadamente sensible, mucho más que el DNA, y por ello al trabajar con el mismo se debe extremar las condiciones (trabajar en frio, en las mayores condiciones de estabilidad, con puntas de pipeta con filtro…).
Cromatografías
Otra técnica es la cromatografía. Este término hace referencia a un gran conjunto de técnicas que permiten separar componentes de una mezcla a través de su afinidad a otra sustancia.
En todos los tipos de cromatografía se utilizan columnas, tubos huecos y abiertos por ambos extremos que se recubren interiormente con una sustancia que formará la fase estacionaria. Esta fase estacionaria de la cromatografía tendrá la misión de retener algún componente de una mezcla que se hará pasar por dicha columna, y de “ignorar” los demás componentes que la atravesarán y se recogerán en otro recipiente.
Finalmente, el componente retenido es eluído, es decir, despegado de la columna y disuelto en otro líquido que tiene más afinidad que la propia columna.
Cromatografía de adsorción
En el caso de la cromatografía de adsorción, se utilizan columnas con la fase estacionaria de sílica o silice. En presencia de elevadas concentraciones de sales caotrópicas como el yoduro de sodio y con pHs ácidos, la sal interacciona con el agua, dejando el DNA y el RNA libre para unirse a la silica. De esta forma, las moléculas de DNA y RNA quedan retenidas a la columna por adsorción.
¡Hagamos un PARENTESIS!
La adsorción (con d) es el fenómeno físico por el que las moléculas de un sólido, líquido o gas quedan retenidas en la superficie de un sólido o líquido. De esta forma sobre el adsorbente se genera una película formada por las partículas del adsorbato. La adsorción se diferencia de la absorción (con b) puesto que en esta última las moléculas se disuelven en el sólido o líquido en lugar de quedar en la superficie del mismo.
Los contaminantes de la muestra son eliminados con posteriores lavados de la columna por centrifugación y finalmente el ADN es eluído con agua o un tampón de resuspensión de baja fuerza iónica a pH neutro o ligeramente alcalino.
En esta técnica el RNA también debe ser eliminado mediante un tratamiento con RNAsas.
Cromatografía de intercambio iónico
Otro tipo de cromatografía utilizada para purificar ácidos nucleicos es la de intercambio iónico.
¡Perdón, pero debo hacer otro PARENTESIS!
Los materiales de intercambio iónico son sustancias insolubles que contienen iones sueltos y unidos que son capaces de ser intercambiados con otros iones de soluciones que puedan entran en contacto con ellos. Este intercambio tiene lugar sin ninguna alteración física en el material de intercambio.
En este método se utilizan columnas con una resina cargada positivamente como fase estacionaria. De esta forma, todo lo que tenga carga positiva atravesará la columna sin ser atraído, y por el contrario, lo que esté cargado negativamente se quedará unido (DNA y RNA, pero también las proteínas).
Posteriormente y para eliminar las proteínas se utiliza una sal como el cloruro de sodio, de forma que por el propio intercambio iónico, las proteínas se irán desuniendo. A continuación, y para eluir el ADN y el ARN, harán falta concentraciones mucho más elevadas de sal ya que se necesitarán más moléculas para desunir todos los enlaces establecidos.
En este punto, sí se pueden separar ADN y ARN. Dado que el RNA, es monocadena y por tanto tiene las bases nitrogenadas expuestas (cargas positivas), estará unido menos fuertemente que el DNA (solo expuestas las cargas negativas de los fosfatos). En este sentido, a concentraciones crecientes de sal, primero será eluído el RNA y después el DNA, por lo que solo deberemos elegir que fracción queremos conservar.
Separación magnética
Este método utiliza esferas magnéticas cuya superficie está recubierta con polímeros que presentan una alta afinidad por los ácidos nucleicos. Las esferas magnéticas se añaden al lisado de la muestra lo que permite su unión a las moléculas de ADN. Cuando se sitúa un imán en la pared o base del tubo, éste permite el agrupamiento en dicha pared de las esferas con el ADN unido, mientras que los contaminantes de la muestra en solución son eliminados por pipeteo o decantación.
Después de varios ciclos de resuspensión y lavado en los que las esferas quedan retenidas por el imán, el ADN es eluído en un tampón adecuado.
OTROS MÉTODOS
Cromatografía de afinidad
En el caso de querer extraer y purificar únicamente la fracción del RNAm (aproximadamente solo el 5% del total de RNA de una célula) se suelen utilizar la cromatografía de afinidad como paso posterior a la purificación con fenol-cloroformo y GI, o como método directo tras la extracción.
En este tipo de cromatografía, las columnas tienen en su superficie interior fragmentos oligoDT (secuencias de timinas), que interaccionarán con las colas de poliadeninas que caracterizan al RNA mensajero. De esta forma, solo esta fracción de RNA quedará retenido en la columna cromatográfica.
Igual que en el resto de métodos cromatográficos, tras varios lavados que eliminen completamente los contaminantes, el RNA mensajero es eluído en un tampón adecuado.
Purificación de plásmidos por lisis alcalina
En el caso de tener que aislar DNA plasmídico y no genómico como en los casos anteriores la lisis celular se realiza a pH básico (con hidróxido sódico), provocando la desnaturalización del DNA. La posterior renaturalización a pH neutro induce a que solo el DNA genómico coagule y precipite.
Esta técnica se basa en el superenrollamiento del ADN. Normalmente, cuando los cromosomas son sometidos a agitación su superenrollamiento se altera quedando estos lineales y en fragmentos, es decir, desnaturalizados. Sin embargo, los plásmido al ser más pequeños y estables solo se semidesnaturalizan sin perder todo el superenrrollamiento.
Si a continuación se vuelve a neutralizar el pH con una sal como el acetato de sodio, los fragmentos del cromosoma hibridarán formando un coagulo y precipitarán. Por el contrario, el plásmido que no está desnaturalizado completamente, se renaturalizará y no coagulará manteniéndose en la fase acuosa. En este punto, al someter la muestra, por ejemplo, a una cromatografía de adsorción, se podrá aislar únicamente el DNA plasmídico.
Aunque estos son los métodos de extracción teóricos más utilizados, hoy en día las compañías encargadas de suministrar el material de laboratorio ofrecen kits comerciales. Estos, aunque incluyen todos los reactivos y tengan sus propios protocolos y recomendaciones, no dejan de estar basados en alguno de estos métodos de extracción.
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