Sabemos que obtener el ADN (o ARN) de una muestra (ya sea humana, de células, de bacterias, tisular…) es útil para analizar la expresión génica, diagnosticar enfermedades hereditarias, analizar mutaciones o estudiar tratamientos en un laboratorio. También sabemos que son varios los métodos de extracción de ácidos nucleicos que nos permiten romper las células y acceder a su material genético: ¡CLICK AQUÍ PARA RECORDARLOS!
Pero, ¿es suficiente con obtener el DNA? ¿Ya podemos trabajar o analizar ese material genético?
No. Antes, debemos comprobar su integridad, es decir, si la calidad después de la extracción es la suficiente para los análisis a realizar, o por el contrario, hemos sido poco cuidadosos y nos lo hemos cargado. Además, en la mayoría de técnicas que utilizan los ácidos nucleicos como material de partida, se requiere conocer la concentración a la que se encuentra para poder trabajar con una cantidad determinada.
En el post de hoy nos acercaremos un poco más al apasionante mundo de las técnicas de laboratorio y hablamos de cómo se analiza la integridad de los ácidos nucleicos y de qué métodos se utilizan para su cuantificación.
¿Todavía estás un poco verde en este tema? Te recomiendo que, antes de adéntrate en la técnicas de laboratorio, leas nuestra sección CIENCIA PARA NOVATOS.
CUANTIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS
1. ABSORBANCIA
El ADN y el ARN pueden cuantificarse directamente midiendo su absorbancia (A), o densidad óptica (DO).
*PARENTESIS. La absorbancia no es más que la cantidad de luz que absorbe una muestra, de lo que sea: de bacterias, de DNA, de células. Así, es fácil entender que cuanto mayor sea la concentración de una muestra mayor será la cantidad de luz absorbida, y menor la luz capaz de atravesar dicha muestra.
Para verlo fácilmente: imagina una ventana con una maceta justo en la repisa. La luz que atravesará la ventana será mucho menor que si no tuviéramos maceta. La maceta entorpece, absorbe, el paso de la luz. Esto es lo que debes entender.
Teniendo en cuenta que cada molécula absorbe la luz a una longitud de onda específica (los ácidos nucleicos a 260 nm), es posible calcular su concentración en una muestra.
*PARENTESIS DE NUEVO. La luz no deja de ser un tipo de energía que se propaga en forma de ondas. La longitud de onda mide la anchura de esas ondas en nanómetros (nm). Así, mientras que la luz visible tiene una longitud de onda determinada, la luz UV tiene otra, los rayos X otra…
Pero sigamos. Con arreglo a la ley de Lambert-Beer, existe una relación lineal entre la absorbancia A y la concentración de la molécula, conforme a la siguiente ecuación:
A = DO = ε x l x c
donde ε es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración y l es el paso de luz del recipiente donde se coloca la muestra (su anchura).
¿Cómo se mide la absorbancia de la muestra?
Con un aparato llamado espectrofotómetro. El aparato funciona conforme a un principio sencillo: se irradia una muestra con una radiación luminosa de longitud de onda conocida y se mide la energía luminosa transmitida con una célula fotoeléctrica situada detrás de la muestra.
Este es el principio que se utiliza con más frecuencia para cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos que hemos conseguido extraer. Además, es útil también para analizar la presencia de contaminantes en la muestra, es decir, de otras moléculas que no son ácidos nucleicos (proteínas, carbohidratos, compuestos como el fenol…)
La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un “cociente”.
En el caso de las proteínas, dado que absorben la luz a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 (es decir, absorbancia medida a 260 nm dividida entre la absorbancia medida a 280 nm) para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0.
En el caso de otros contaminante como hidratos de carbono, fenoles u otras sustancias, se utiliza el cociente A260/A230. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente.
Aunque la cuantificación de ácidos nucleicos por espectrofotometría es la técnica más utilizada, no es un método completamente específico, pues puede medir nucleótidos que se encuentren dispersos o incluso hebras de DNA.
2. FLUORIMETRÍA
Para solventar las limitaciones de la espectofotometría aparece la fluorimetría. En este caso, se utiliza un compuesto fluorescente que se une, específicamente, a las cadenas de ácidos nucleicos. Es fácil entender que a mayor cantidad de DNA o RNA, mayor compuesto fluorescente se unirá y mayor será la fluorescencia emitida y detectada por el equipo, en este caso llamado fluorímetro.
ANÁLISIS DE LA INTEGRIDAD
Hemos conseguido calcula la concentración de ácidos nucleicos extraídos, pero ¿Cómo sabemos que están íntegros? ¿Qué no están fragmentados? ¿Qué nos sirven para nuestro posterior análisis? Debemos comprobar su integridad.
1. ELECTROFORESIS DE AGAROSA
¿Qué es la electroforesis?
Aunque hablaremos más en detalle en otro post, el principio de la electroforesis es simple. Todo pasa por preparar una lámina de gel porosa (el material se llama agarosa) a la que se le aplica un campo eléctrico. Si colocamos los ácidos nucleicos en el extremo negativo de la lámina, y tenemos en cuenta su carga negativa normal, es fácil entender que tratarán de desplazarse hacia el polo positivo del gel.
Para ello, tendrán que migrar a través de los poros del gel de agarosa. Esta migración variará en función del tamaño de los ácidos nucleicos. Cuanto más grande sea la molécula, más complicado le resultará a atravesar los poros. Cuanto más pequeño sea el ácido nucleico más rápido migrará hacia el polo positivo.
¿Cómo hacemos visible el resultado de esta prueba?
Se añade a las muestras antes de “correrlas en el gel” un compuesto que se intercala entre las cadena de ácidos nucleicos. Después, al irradiar el gel con luz UV se observa un patrón de bandas.
¿Cómo se determina la integridad?
En este caso no se puede asignar un valor numérico real a la integridad de la muestra dado que la electroforesis es un método cualitativo.
Sin embargo, se considera que una muestra de ADN es íntegra cuando su perfil en una electroforesis en gel de agarosa se corresponde a una banda discreta. El nivel de degradación de una muestra está determinado por la pérdida de definición de la banda predominante y el acompañamiento de una estela o smear a lo largo del gel.
En el caso del RNA, se puede catalogar como íntegro si se observan dos bandas (correspondientes a los RNA ribosomales) en la parte baja del gel, y si la proporción entre ambos es de 2.
Sin embargo, el hecho de que el resultado de una electroforesis muestre el DNA o el RNA poco integro no indica que no nos sea útil para nuestro análisis posterior. Quizás queremos analizar una región concreta y pequeña respecto al material total y esta sí presenta una buena integridad.
2. PCR
Para comprobar la funcionalidad y determinar con mayor exactitud el grado de integridad de las muestras de ADN se puede optar por realizar una PCR (Polimerase chain reaction).
Si quieres hacer un repaso a la técnica de la PCR: ¡CLICK AQUÍ!
La reacción en cadena de la polimerasa permitirá determinar si la región génica que nos interesa está integra o no. Si el resultado es la amplificación por PCR, podremos confirmar que la región molde o de partida que nos interesa tiene buena calidad y no está degradada.
Otro tipo de PCR que también podría ser útil en este sentido es la PCR múltiple de gran tamaño molecular o Long PCR múltiple. En esta, se combinan simultáneamente 5 parejas de oligonucleótidos que amplifican en diferentes cromosomas fragmentos de ADN. En este sentido, sería útil para comprobar la integridad más a nivel general de la muestra.
3. ELECTROFORESIS CAPILAR
Finalmente y como técnica más novedosa se puede optar por la combinación de electroforesis capilar con fluorescencia.
En esta técnica, basada en la electroforesis común, pequeñas cantidades de muestra de ácidos nucleicos son separadas por su carga y detectadas mediante fluorescencia. La única diferencia es que la separación se produce en un capilar en lugar de en un gel de agarosa.
*En este caso en lugar de ser un material poroso lo que dificulta la movilidad de los ácidos nucleicos es una corriente de cargas que arrastra la muestra.
El resultado se visualiza en forma de electroferograma donde la cantidad de fluorescencia medida se correlaciona con la cantidad de ADN de un tamaño determinado.
El software del equipo calcula un algoritmo a partir de la información obtenida del electroferograma resultante. El valor obtenido se denomina DIN (DNA Integrity Number) y proporciona un valor numérico a la integridad del ADN.
Esta alternativa también es útil para el RNA. En este caso, el electroferograma es capaz de otorgar mucha más información del estado de degradación de la molécula de RNA que simplemente el ratio de RNA ribosomal que se consigue visualizando el gel de agarosa. También proporciona lo que se conoce como RIN (RNA Integrity Number).
Y hasta aquí las técnicas más utilizadas que utilizamos en los laboratorio para comprobar la integridad y cuantificar las muestras de ácidos nucleicos (ADN y RNA).
¿Se te ha quedado corta la explicación sobre la electroforesis? ¿Necesitas más información? Próximamente, hablaremos más en detalle de la electroforesis… ¡NO TE LO PIERDAS!
