Biotecnología

Prime Editing: La mejora del sistema CRISPR-Cas9

Por octubre 27, 2019 One Comment
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Si todos pensábamos que el sistema CRISPR-Cas9 iba a ser el mayor logro de la ciencia en el campo de la ingeniería genética, nos equivocábamos. Prime editing, la versión mejorada de CRISPR, permite editar secuencias génicas en un solo paso, y podría llegar a solucionar el 90% de las enfermedades genéticas. ¿En qué consiste? ¿En qué se diferencian? ¿Para qué podría ser útil? ¡Sigue leyendo!

Creo que el sistema CRISPR-Cas9 ha sido, y es, uno de los temas más recurrentes de esta web y sus redes sociales. Sin embargo, y para ponernos en situación, necesitamos refrescar un poco la memoria de todo aquel que ande un poco despistado. CRISPR-Cas9 consta de 2 elementos fundamentales. En primer lugar, la endonucleasa Cas9, una enzima capaz de realizar un corte de doble cadena (DBS) en una molécula de DNA. Por otro lado, un RNA guía, una molécula de RNA, de aproximadamente unos 20 nucleótidos, encargada de unirse a la Cas9 y guiarla (de ahí su nombre), a una zona del DNA específica. ¿Qué zona? La zona complementaria a esta guía de RNA.

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https://montoliu.naukas.com/2019/10/22/edicion-de-calidad-pe-la-nueva-herramienta-crispr-para-colorear/

Por tanto, y como todos sabemos, podemos diseñar la guía de RNA, decidir qué secuencia de nucleótidos ponemos, para guiar a Cas9 a la zona del genoma que nos interese editar. Una vez realizado el corte, la célula en cuestión tiene dos opciones. Una, “lijar y pegar” los extremos de la rotura. O dos, utilizar un molde para reparar ese corte.

Si nuestra misión es interrumpir un gen con la finalidad de “apagarlo” (esto se conoce como knock out), la primera opción nos sirve. ¿Por qué? Porque en este proceso la célula puede eliminar o añadir nucleótidos al azar y sin sentido alguno, y el resultado más probable es la aparición de un codón de STOP o bien la alteración del marco de lectura. ¿En resumen? Ese gen deja de ser funcional, y la proteína para la que codifica jamás se sintetizará.Prime_Editing_CRISPR_Cas9_Biotecnologia_Maria_Iranzo_Biotec

¿Qué ocurre si lo que queremos es corregir una mutación que está afectando a la funcionalidad de ese gen?

La segunda opción. Necesitamos que la célula arregle ese corte de doble cadena pero introduciendo los cambios que a nosotros nos interesan. En este caso, además de la Cas9 y la guía de RNA, se requiere un tercer elemento, una secuencia molde. Esta secuencia es, de nuevo, diseñada a nuestro gusto, de forma que las enzimas de reparación de la propia célula utilizarán ese molde exógeno y editarán la zona cortada del DNA.

Y es aquí donde Prime Editing aparece para mejorar esta segunda aplicación del sistema CRISPR-Cas9. Este nuevo sistema va a requerir de tres componentes. En primer lugar una enzima Cas9 que únicamente corta una de las dos cadenas del DNA (se llama Cas9 nickasa). Por otro lado, una especie de guía de RNA que funcione tanto de guía como de molde. Esta molécula ha sido bautizada como pegRNA (prime editing guide RNA), y se caracteriza por tener, en un extremo la zona de unión a la Cas9 y la guía que la dirige a la zona a editar; y por otro lado, el molde que se usará para reparar la rotura provocada. De esta forma, ya no se requiere de la adición de un molde exógeno al sistema.

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https://montoliu.naukas.com/2019/10/22/edicion-de-calidad-pe-la-nueva-herramienta-crispr-para-colorear/

¿Pero dónde está el truco? En el tercer componente de este nuevo sistema, una transcriptasa reversa, que se va a introducir conjugada a la Cas9.

El proceso de transcripción, por si a alguien se le ha olvidado, es la transformación del DNA al RNA. Después, con la traducción, el RNA se convierte en las proteínas que desempeñarán las funciones que ordene dicho DNA. Este es el flujo normal de nuestras células. ¿Qué creéis que hace una transcriptasa reversa? Lo que su nombre indica, realizar el proceso de transcripción pero en el sentido contrario: de RNA a DNA.

La gracia del sistema está en que la transcriptasa reversa utilizara ese molde de RNA que contiene el pegRNA, transformándolo en DNA, para reparar la rotura inducida por Cas9. ¿Maravilloso verdad?

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https://www.broadinstitute.org/visuals/prime-editing-search-and-replace-genome-editing

Pero ¿cómo ocurre todo este proceso?

Cuando en una célula aterriza todo este sistema, lo primero que sucede es que el pegRNA va a arrastrar a la Cas9 y a la transcriptasa reversa a su zona complementaria del genoma. Una vez allí, Cas9 cortará la cadena complementaria del DNA. Esta rotura será reparada por la transcriptasa reversa utilizando como molde la cola extra del pegRNA. A su vez, las endonucleasas propias de la célula retirarán el viejo fragmento sobrante.

Si habéis entendido el proceso, ahora nos encontraríamos con una situación insostenible: las dos hebras del DNA no son complementarias ya que una está editada y la otra no. Este fenómeno se denomina mismatch. Pero tranquilos porque este sistema también se encarga de esto: la propia Cas9 introducirá un nuevo corte en la secuencia sin editar, y en este caso será la propia célula la que detectará la rotura. Las enzimas de dicha célula utilizarán como molde la hebra ya editada para reparar el corte. ¿El resultado? Las dos cadenas de la molécula del DNA editadas a nuestro gusto.

¿Sorprendente verdad? ¿Cuáles son las ventajas frente a CRISPR-Cas9? En primer lugar que no se requiere un molde exógeno para reparar la rotura puesto que el molde ya va incorporado en el sistema. Por otro lado, tal y como destaca LLuis Montoliu: “Las ediciones se obtienen con una menor variabilidad (menos INDELs (inserciones-deleciones)) y con un menor número de mutaciones no deseadas en regiones similares del genoma (off-targets) que las obtenidas con la Cas9 tradicional”.

Además, se trata de un sistema mucho más preciso para corregir pequeñas mutaciones: las cuales suelen ser responsable de las enfermedades genéticas. La anemia falciforme, por ejemplo, es una enfermedad hereditaria que está causada por un solo cambio de nucleótido. En vez de una adenina, es una timina lo que aparece en una región del gen que codifica para la β-globina, una de las subunidades de la hemoglobina. ¿El resultado de este mínimo cambio? La hemoglobina posee una menor afinidad por el oxígeno y aparece la anemia.

Como este, son mucho los casos de enfermedades inducidas por pequeñas mutaciones. En este panorama, se estima que Prime editing, podría solucionar hasta el 90% de las enfermedades de este tipo. Y por el momento, ya ha podido corregir con éxito las mutaciones que causan la anemia falciforme, la enfermedad de Tay-Sachs, y realizar con éxito la incorporación de una variante génica que protege de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

¿Desventajas? No permite modificar grandes fragmentos debido a la limitación de tamaño del pegRNA. Y por el momento, la mayor eficacia se ha observado solo en ciertos tipos de células humanas, teniendo que testar, todavía, su uso en modelos in vivo y en otras líneas celulares.

Como decimos siempre: por el momento, solo queda esperar a que las investigaciones avancen. Nosotros seguiremos atentos a la evolución de esta nueva revolución en el campo de la ingeniería genética.

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REFERENCIAS BIBILOGRÁFICAS:

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4

https://montoliu.naukas.com/2019/10/22/edicion-de-calidad-pe-la-nueva-herramienta-crispr-para-colorear/

https://genotipia.com/genetica_medica_news/prime-editing-nueva-herramienta-de-edicion-del-genoma/

https://www.broadinstitute.org/visuals/prime-editing-search-and-replace-genome-editing

 

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